技術服務描述:
螢光素酶是理想的報告基因,因為哺乳動物細胞中不含內源性螢光素酶,一旦轉錄完成立刻就生成功能性的螢光素酶。單報告基因實驗往往會受到各種實驗條件的影響,而雙報告基因則通過共轉染的“對照”作為內參為實驗提供一基準線,從而可以在最大程度上減小細胞活性和轉染效率等外在因素對實驗的影響,使得數據結果更為可信。Dual-Luciferase雙螢光素酶報告基因檢測系統在細胞中同時表達螢火蟲螢光素酶和海腎螢光素酶,兩者沒有種源同源性并對應不同的反應底物,故而沒有交叉干擾。得益于超強的光信號和超高的信噪比,本系統被廣泛用于miRNA靶基因驗證。
由于miRNA主要通過作用于靶基因的3’UTR起作用,可以將目的基因3’UTR區域構建至載體中報告基因luciferase的后面, 通過比較過表達或者干擾miRNA后,報告基因表達的改變(監測螢光素酶的活性變化)可以定量反映miRNA對目的基因的抑制作用;結合定點突變等方法進一步確定miRNA與靶基因3’UTR的作用位點。
常用載體:
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轉錄因子是一種具有特殊結構、行使調控基因表達功能的蛋白質分子,也稱為反式作用因子。某些轉錄因子僅與其靶啟動子中的特異序列結合,這些特異性的序列被稱為順式因子,轉錄因子的DNA結合域和順式因子實現共價結合,從而對基因的表達起抑制或增強的作用。螢光素酶報告基因實驗(luciferase Assay)是檢測這類轉錄因子和其靶啟動子中的特異順序結合的重要手段,其原理簡述如下:(1)用靶啟動子的特定片段替換報告基因質粒(如pGL3-basic)的啟動子區。(2) 將要檢測的轉錄因子表達質粒與報告基因質粒共轉。如果該轉錄因子能夠激活靶啟動子,則螢光素酶就會表達,且其表達量與轉錄因子的作用強度成正比。(3) 加入特定的底物,螢光素酶與底物反應,產生螢光素,檢測熒光的強度可以對螢光素酶的活性定量,進而判斷該轉錄因子能否與靶啟動子片段發生作用 (及其作用強度)。
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